疫苗是史上最成功的医学发明之一。对于免疫原性较低的抗原，佐剂或可增强免疫响应，其机制之一是激活免疫细胞的模式识别受体（PRRs），进而启动一系列的免疫应答，促进抗体和细胞因子的产生。多种糖类分子，作为微生物表面的重要信号，可有效激活PRRs，从而具有作为佐剂材料的潜力。阐明这些糖分子的免疫调节机制，将对指导未来疫苗佐剂的设计提供理论基础。澳门大学王春明教授、母若雨博士，与南京大学董磊教授在Cell Press细胞出版社期刊Trends in Immunology发表综述论文，总结了基于糖类佐剂的最新发展趋势，着重讨论了多糖、寡糖或糖聚合物的物理化学特性——包括分子大小、组装状态、单糖成分和官能团模式等——如何影响抗原呈递与免疫应答的过程。
虽然佐剂已经广泛应用于现代疫苗开发，但即使是最经典的铝基佐剂和广泛使用的佐剂系统04 (AS04)，其作用机制仍不够清晰。随着对先天免疫系统认识的不断加深，逐渐发现Toll样受体(TLRs)、C型凝集素受体(CLRs)和NOD样受体(NLRs)等PRRs通过识别微生物的病原体相关分子模式（PAMPs），触发胞内信号，启动免疫响应。因此可以通过模拟病原微生物表面的PAMPs的结构来设计PRRs激动剂。糖类分子是许多病原微生物PAMPs的组成部分。例如，细菌PAMPs：脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)；真菌PAMPs：β-葡聚糖和甘露聚糖，均可刺激一些PRRs，例TLR4和Dectin-1，表现出佐剂活性。尽管目前基于糖类佐剂的研究不断增多，但其结构复杂性、合成难度高、研究技术缺乏等挑战阻碍了对糖类潜在佐剂活性的分子基础的探索。
影响糖类分子与PRRs相互作用的关键因素
影响糖类分子的生物活性及其识别和激活PRRs的决定性因素有很多，包括分子质量、溶解度、单糖组成、官能团取代度等（图1）。
- 分子量/可溶性
分子量大小是所有聚合物的基本特征，包括多糖。早期研究发现，只有大分子量颗粒型多糖才具有免疫激活作用。例如，可溶性和不可溶性的真菌多糖均可以结合Dectin受体，但是只有后者能诱导有效的受体聚集和激活。然而最新研究表明，可溶性(~20 nm)的白色念珠菌来源的甘露聚糖注射到小鼠背部皮下后，不诱导外周免疫反应，但可直接进入引流淋巴结(dLNs)，启动淋巴结先天免疫响应。这一发现可能为佐剂设计和疫苗开发提供一个新思路。
- 官能团及单糖组成
糖类的官能团模式也影响其与PRRs的识别。例如，由几丁质去乙酰化得到的壳聚糖可以通过激活NLRP3炎症小体，激活巨噬细胞免疫响应，而原本几丁质没有这种活性。此外，果胶与TLR2-1之间的识别除了受甲酯化修饰程度的调控外，还依赖甲基酯的分布。一项临床试验发现乙酰基也会影响果胶的生物学功能：O -乙酰化果胶可在健康志愿者体内有效诱导IgG的产生，但不会引发严重的疫苗相关不良反应。
多糖中的单糖结构也影响其与PRRs之间的精确相互作用。之前认为DC-SIGN和L-SIGN，作为密切相关的CLR，它们识别的单糖组成结构是类似的。但最新的研究发现，相较于DC-SIGN，L-SIGN与N -甘露聚糖具有更高的结合亲和力。
- 高级构象
糖类一级结构的改变会影响其高级构象，也会影响其与PRRs的识别。例如，乙酰化可改变葡甘聚糖的亲疏水性。随着修饰度的增加，乙酰化葡甘聚糖的结构可以从线性转变成颗粒状，并在当乙酰基的修饰度达到1.8时形成较为均一的200-300纳米大小的颗粒，可通过特异性激活巨噬细胞表面的TLR2，启动免疫响应。此发现表明精细调控糖分子组装而成的三维形态有助于产生生物活性。
- 与其他PRRs激动剂协同作用
糖类不仅可以单独作为免疫激动剂，还可与其他PRRs激动剂协同作用。例如一种新型佐剂p(Man-TLR7)，是由甘露糖和TLR7激动剂组成的共聚物。它通过识别甘露糖受体（MR）促进树突状细胞（DCs）的摄取，并在细胞内激活TLR7促进DC活化，从而实现MR与TLR7之间的协同作用。此外，多糖自身也可诱导不同PRRs之间的协同合作。有研究发现葡甘聚糖可同时激活TLR4和MR。以上的发现提示我们在佐剂设计中可以考虑糖类对PRRs的协同作用。
糖类为基础的PRRs激动剂作为疫苗佐剂调控免疫响应的方式
基于糖类的PRRs激动剂参与调节免疫应答的方式主要通过以下三个方面：（1）抗原运输途径（图2）；（2）抗原摄取和呈递（图3）；（3）适应性免疫应答（图4）。
1.调控抗原运输途径
一般疫苗是经皮下或肌肉注射，在次级淋巴器官产生适应性免疫应答。因此佐剂的作用是在注射部位诱导局部免疫环境产生趋化因子，招募抗原提呈细胞（APCs），启动细胞介导的抗原转运，将抗原运输到dLNs。然而，某些病毒、纳米颗粒或可溶性蛋白可直接通过淋巴管进入淋巴结中，激活淋巴结中的巨噬细胞、DCs或B细胞。有研究发现直径5 ~ 100 nm的纳米颗粒可以通过淋巴管运输到淋巴结中，大于100 nm的颗粒可能被困在注射部位的细胞外基质中，需经APCs吞噬处理后才能迁移至LNs，小于5 nm的颗粒会通过血液内皮基底膜扩散，直接进入循环。因此可以通过调控疫苗输送系统的大小来调节抗原运输的路径，从而获得不同的免疫效果。
2.调控抗原摄取及抗原呈递的方式
T细胞免疫应答的启动依赖于APCs对抗原的摄取和呈递。抗原被APCs摄取后，在溶酶体中被降解成多肽，装载在MHC II分子上并运输到细胞表面激活CD4+ T辅助细胞。此外，被摄取的外源性抗原可能出现溶酶体逃逸现象，由MHC I分子呈递，诱导CD8+ T细胞应答，称为交叉呈递。一些基于糖类的佐剂可以调节抗原呈递的方式。例如，基于皂苷的佐剂(SBAs)可在细胞内形成脂质体(LBs)，并通过PKR样内质网激酶(PERK)通路实现外源性抗原的交叉呈递。此外，还有一项有趣的研究发现，不仅肽段可以由APCs呈递给T细胞，糖缀合疫苗的多糖成分也可以由MHC II呈递并激活糖类特异性CD4+ T细胞（Tcarbs）。
3.调控适应性免疫应答
基于糖类的佐剂还可参与调控适应性免疫应答。例如，一种基于菊粉的多糖佐剂，可同时有效地诱导Th1和Th17免疫反应。类似地，壳聚糖也可有效的诱导Th1免疫应答。同时还发现，多糖结构也会影响适应性免疫应答的类型。例如，酵母细胞表面含有β-1,3-葡聚糖的多糖可以诱导DCs分泌IFN-γ，促进Th1细胞分化。而另外一种甘露聚糖/β-1,6-葡聚糖(MGCP)多糖成分，诱导小鼠naive CD4+ T细胞向调节性T细胞(Treg)分化。此外，基于糖类的激动剂还可直接作用于B细胞(也表达PRRs)并触发体液免疫。有研究发现，壳寡糖(COS)可直接通过激活草鱼脾脏IgM+ B细胞的MR和整合素，诱导B细胞增殖和分化。
