多糖作为一类天然来源的生物材料具有丰富而又微妙的生物活性，它不仅能够经由糖类识别受体 (Carbohydrate-recognizing receptor)直接发挥作用，也能通过与生长因子的动态结合，达到对免疫细胞活性间接调节的目的。但多糖材料自身物理性质的不足限制其进一步的开发利用。尤其是在3D打印领域，由于挤出形成的多糖微丝(filament)内部分子间作用力弱，致使微丝沉积在接收平台之后便迅速发生塌陷、融合，无法堆积形成预设的三维结构，已成为一个普遍的困扰。纵观目前3D打印生物材料发展多年，可直接用于打印的“墨水”寥寥无几，而基于多糖的也围绕在海藻酸钠（alginate）等屈指可数的一两类分子，且大多会在打印进行预处理。的确，多糖材料往往需要通过化学修饰或者与其它材料共混来解决微丝“内部”强度不够，或者液态-胶态转变(sol-gel transition)慢的问题。然而，这些方式不可避免地会为体内活性的研究引入额外变量，有可能掩盖了糖结构自身的微妙和精确的生物活性，并且增加了材料均一性的控制难度。
澳门大学王春明教授团队一直以葡甘聚糖及其衍生物为模型，开发不同种类的免疫活性生物材料；然而，却因糖类本身的“不可打印性”，无法尝试3D打印这一对他们的多糖研究来说“既成熟、又新鲜”的工具。用课题负责人的话来说，“心和手都痒痒的”，他们进而决定深入探索一种可以不通过化学修饰而打印葡甘聚糖的技术，并期望这一技术可以应用于不同结构、不同理化性质的多糖打印，甚至有可能接近或成为一种普适方法。团队受金属加工过程中的淬火(quenching)工艺启发，开发了一种直接打印天然多糖材料的非溶剂淬火(NSQ)的打印技术。该技术利用溶剂交换的原理，用可与水互溶，但不能溶解多糖的非溶剂(non-solvent)，来诱导微丝界面发生过饱，进而使处于界面的多糖发生固化(quenching)，从而实现“锁水”(water-locking)，使多糖材料形状保真度(Shape-fidelity)得到显著提升。此外，研究团队使用基于NSQ打印的栅格支架，发现得到精细加工之后的多糖材料能够实现更加精确的免疫调节活性。相关工作联合南京大学董磊教授与解放军总医院孙晓艳教授，以题为：A “non-solvent quenching” strategy for 3D printing of polysaccharide scaffolds with immunoregulatory accuracy发表在Advanced Science杂志上。
- 非溶剂的筛选与原理验证
研究者认为理想的非溶剂需要具备以下条件，第一，界面固化速度快，保证微丝在塌陷前就通过外部定型，锁住了内部的水；第二，溶剂置换之后的微丝不能发生过度的形变，否则不利于打印过程中保真度的维持。因此，他们选择了5种具有不同理化性质的天然多糖，首先展开了对各自最适非溶剂的筛选。接下来，团队以直链葡甘聚糖(GM)为例，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)于它而言能够快速实现表面固化，同时不会导致微丝直径的过度收缩，因此可作为GM的适宜非溶剂。接来下，他们从溶剂、非溶剂与多糖材料亲和性的角度分析不同非溶剂是如何影响多糖直径变化的。团队借助了溶解度参数的概念，通过计算拟合，发现非溶剂的分散性以及极性可能是影响直径变化的潜在因素。进一步的，研究者通过分析微丝的径向结构，观察到微丝径向上由外向内呈现出由致密到疏松多孔的结构变化，证实了“锁水”的设想。
- NSQ打印方法的探索与普适性考察
GM作为研究团队长期关注的多糖，因此围绕GM展开了打印工艺的探索。他们以材料的挤出性作为浓度选择的依据，通过流变性能的考察发现，相比于传统的打印方式(CP)，NSQ能赋予GM更广的打印窗口，即使在较低粘度下，也能保障挤出的多糖溶液形成微丝而非液滴。进一步的，研究者以经典的栅格结构作为打印模型，通过外观观察以及可打印值(Pr)进行定量，发现五种天然多糖材料的形状保真度均得到显著提升，且具备制造复杂结构的能力。此外，他们还发现，支架在非溶剂中能够长时间地存放，因此增加了NSQ支架在商业以及临床应用中的潜力。
- NSQ打印多糖支架的免疫活性考察
GM的活性除了通过其自身重复的甘露糖和葡糖糖单元被多种先天的免疫受体识别来介导之外，其尺寸、自组装行为和侧链等同样影响着多糖相关受体的识别与激活。为了研究NSQ方法可否保持和展现多糖丰富、微妙的免疫调节活性，研究者将支架植入到皮下进行观察，以相同体积大小的块状多糖凝胶(Bulk)作为对照，同时比较了通过CP以及NSQ法所得打印支架与宿主的相互作用，其中，NSQ支架加工成了微丝间距分别为1.5 mm(NSQ-1.5)以及2.5 mm(NSQ-2.5)的栅格结构。研究者分别从组织、细胞以及基因三个方面比较了四种支架对异物反应的影响。他们发现通过NSQ打印的支架具有与Bulk以及CP完全不同的免疫响应，而后两者之间没有观察到差异。其中，NSQ-1.5 对血管生成的影响更大，而 NSQ-2.5 更为直接地影响着细胞外基质的重塑。
4．NSQ赋予多糖差异性调控原因探究及验证
不同间距的微丝所带来的局部力学性质的差异可能会经由机械传导通路(mechanotransduction pathway)带来不同的免疫效应。研究者分别对局部模量进行了归一化计算以及对生物力学通路YAP/TAZ中目标基因的表达水平进行分析，发现两者具有相似的力学性质，并且相关基因的表达水平无显著性差异，由此排除了生物力学的因素；基因测序的结果表明，糖类识别受体中，TLR2的表达水平在组间有较大的差异，研究团队猜测该受体可能在宿主识别不同结构支架中发挥着重要作用，因次，他们通过Tlr2-/-敲除小鼠进行验证，发现之前观察到的组间差异都消除了，认为TLR2的差异性激活可能是造成上述结果的关键原因。进一步的，为了探究修饰后的多糖材料是否能同样带来差异性的免疫调控，研究者将GM进行乙酰化修饰(GMAC)使其能够通过传统方式进行打印。结果表明，同样几何结构下，并未观察到在NSQ打印支架中出现的差异。相反，具有不同形貌的GMAC支架，均展现强烈且相似的炎症反应，研究者猜测，剧烈的免疫反应可能是掩盖几何结构诱导天然多糖差异性调控的潜在原因。
综上所述，NSQ创新性地将“淬火”的概念从金属加工引入到了天然多糖打印，该方式有如下特点：1）一定程度上拓展了多糖材料打印窗口的边界；2）有利于多糖支架的长期保存；3）通过提升天然多糖材料打印的保真度，赋予多糖材料物理手段诱导的微妙调控作用；4）不涉及化学修饰或引入其他材料，最大程度地保留了多糖固有生物活性，因而避免了化学修饰带来的潜在影响。
（https://mp.weixin.qq.com/s?src=11×tamp=1705915114&ver=5034&signature=pBrKOLhzGXvH8f66kZb5yW0E*CT1wDBsIEw-2D3zsmr5ny6nhMMhKxJeqND6cBDmP*dEEiRIAys5UV4Kl8UXXypAm0B9TACpL1SEvW3pYJfY4Ov6ZP*6rKAtKW4MOuMZ&new=1）
